Biotechnologie 2

Rek. Proteinproduktion, 2019-11-21

Wie läuft die Expressionsvektorherstellung und Proteinexpression in einem baculoviralen System ab?

Expressionsvektorherstellung
  • Einbringung  durch Baculoviren:
    • Baculovirales Expressionvektorsystem: rekombinierter Bacmid Shuttle Vektor, doppelsträngige, filamentöse DNA-Viren.
      • Baculoviren wurden genetisch verändert, produzieren kein Polyhedrin (Haupthüllprotein) mehr.
      • Polyhedrin Gen wird durch rek. Gen ersetzt. Werden aber trotzdem von den Zelle aufgenommen.
    • Beispiele für solche Expressionssysteme:
      • Autographa californica: Multicapsid Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)
      • Bombyx mori (Seidenspinner): Nuclear Polyhedrosis Virus (BmNPV)
  • Expressionssignale:
    • Promotor des viralen Strukturproteins Polyhedrin (20 % des Gesamtproteins)
    • p10 Promotor
    • Expressionslevel zwischen 1 und 600 mg/l Kulturmedium.
  • His-Tags und GST sind auch bereits verwendet worden.
 
Proteinexpression
  • Bakulovirus Infektion beeinträchtigt schwer den Sekretionsweg der Insektenzellen. Daher Produktion meist intrazellulär.
  • Lytischer Infektionszyklus: Proteine werden von Promotoren, die spät eingeschaltet werden (late  promoters) reguliert: Bei Lyse werden Proteasen frei und posttranslationale Modifikationen werden nicht vollständig durchgeführt.

  • Problem: Säugetierglycoproteine mit authentischen Oligosaccharidketten (N-Glykosylierung) zu produzieren

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