Biotechnologie 2
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Grüne Biotechnologie

Nennen Sie mögliche direkte Transformationsmethoden für Pflanzenzellen und beschreiben Sie ein Beispiel Ihrer Wahl im Detail.

 Methoden des direkter Gentransfer
  • Physikalische Methoden, bei denen DNA direkt in Pflanzenzellen gelangt
  • Verlangt größere Mengen an DNA und vorübergehend durchlässige Pfanzenzellen --> DNA gelangt direkt rein
  • Einbau kann in Zellorganellen-DNA oder Kern-DNA erfolgen
  • Auch transiente Transformierung möglich
  • Es ist wichtig, dass man jeweils eine geeignete Methode findet
 
Verschiedene Methoden: 
  • Gentransfer duch particle bombardment (Genkanone)
    • Au oder W Partikel, mit DNA ummantelt
      • 0,6 - 2 μm
    • Durch He Druckquelle stark beschleunigt --> Eindringen in Zielgewebe
    • DNA wird in Zelle freigesetzt
    • Kann Stabil ins Genom integriert werden oder transiente Genexpression
    • Relativ alte Methode (1987):
      • Verwendet von Transformation von praktisch allen Getreidearten (zB BT-Mais)
    • Für stabile Integration müssen die beschossenen Gewebebereiche zu intakten Pflanzen regeneriert werden
    • DNA-Menge ist sehr wichtig --> 
      • Zu Wenig: geringer Transformationeffizienz
      • Zu Viel: Hohe Genkopien in Zelle --> Gefahr von Gen-Silencing und Rearrangements

  • Elektroporation
    • Routinemethode bei Bakterien
    • Auch mit Protoplasten und intakten Pflanzengewebe
    • Es entstehen wahrscheinlich Poren, durch die DNA diffundieren kann
    • heute nicht verwendet --> es gibt bessere Methoden

  • Mikroinjektoin
    • Standardprozedur bei tierischen Zellen
    • Bei Pflanzen wird es wegen hohem Zeitaufwand und hoher Kosten heute nicht mehr verwendet
    • Wurde mit Protoplasten und pflanzlichen Embryonen erfolgreich durchgeführt

  • Protoplastentransformation
    • Nackte Pflanzenzellen (Zellwand durch Enzyme abgebaut) in geeignetem osmotischen Medium mit DNA inkubiert
    • DNA wird gut von Protoplasten aufgenommen
    • Funktioniert besonders gut bei Solanoceae
    • Auch verwendet für somatische Hybridisierung:
      • Genetisch unterschiedliche Protoplasten werden miteinander verschmolzen (1995 --> Tomoffel)
    • Ev. Zusatz von Polyethylenglykol:
      • PEG, wirkt perforierend auf die Membran, zusätzlich wird durch die Gegenwart von Calcium-Ionen die Aufnahmefähigkeit für freie DNA erhöht, die dann mit einer bestimmten Frequenz in die Chromosomen der Pflanzenzellen eingebaut wird. Ausgangsmaterial für diese Methode sind Protoplasten und Pollen.
 
 
Zusatz zu Elektroporation:
Elektroporation ist eine Methode, Zellmembranen vorübergehend permeabel (durchlässig) zu machen, um so Makromoleküle, wie DNA oder Proteine, in Zellen oder Gewebe einzuschleusen.[1] Die Elektroporation wird in der Molekularbiologie häufig zum Transfer von Nukleinsäuren in prokaryotische (Transformation) und eukaryotische (Transfektion) Zellen verwendet. Im Bereich der Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik kann die Elektroporation zur Besserung von Massentransportprozessen oder zur Inaktivierung von Mikroorganismen eingesetzt werden.
 
Durch ein elektrisches Feld, das in der Regel als kurzer Puls durch den Entladungsstrom eines Kondensators erzeugt wird, wird die Zellmembran von im Kondensator befindlichen Zellen aufgrund verschiedener Effekte permeabilisiert. Ob die Zellmembran dabei tatsächlich Poren bildet, ist umstritten. Es könnte von Feldstärke und Dauer der Impulse abhängen. Beispielsweise kann sich die Konformation von Membranbestandteilen verändern. Beobachtet wird auch das Abschnüren von Membranbereichen zu Vesikeln, welche den Import von Makromolekülen und Organellen erklären können. Der Effekt der Elektroporation wurde erstmals von Neumann 1982 beschrieben.[2] Durch die temporäre Permeabilisierung kommt es zur Freisetzung von intrazellulären Bestandteilen, induziert durch hydrostatische Druckunterschiede (Turgordruck) und osmotische Effekte. Außerdem können Substanzen aus dem Außenmedium in das Zellinnere aufgenommen werden (Farbstoffe, DNA, Ionen). Die Elektroporation ist mit allen Zelltypen möglich, da sich jedoch nicht alle Poren wieder schließen, sinkt die Zellviabilität, gegebenenfalls bis zum Zelltod.
 

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