Biotechnologie 2
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Grüne Biotechnologie, 2019-09-12 B

Erklären Sie das Prinzip des indirekten Gentransfers mittels Agrobacterium tumefaciens .

  • A. tumefaciens:
    • Natürlich vorkommendes Bodenbakterium
    • Gram-negativ
    • 5 Versch. Agrobacterium Arten

  • Kann Tumore bei Pflanzen verursachen --> Durchaus Ökonomisch relevant (Wein, Walnuss, Rosen)
  • Induziert bei infizierten Pflanzen einen Tumor (Wurzelhalsgalle) indem einige Gene übertragen werden --> Das nutzt man für gentechnische Veränderung

  • Agrobacterium kann also Pflanzenzellen genetisch verändern
    • Im natürlichen Mechanismus:
      • Bewirkt autonomes Wachstum
      • Agrobacterium aber nur für Tumorinduktion, nicht für aufrechterhaltung des Wachstums notwendig
      • Besitzt also wirklich die Fähigkeit, einen Teil der DNA ins pflanzliche Genom zu integrieren
    • Der relevante Teil der DNA befindet sich auf bestimmten Plasmiden --> Ti Plasmide (Tumor induzierend)
      • Relativ großes Plasmid (200 kb)

  • Mechanismus
    • Verwundete Pflanzen setzen üblicherweise Signale frei (phenol. Verbindungen oder Zucker)
    • Das zeigt Agrobacterien die  Anwesenheit von geeigneten Angriffststellen an
    • Aktiviert die vir-Region
    • Die Bakterien setzen sich an Zellen fest (zuerst Polysaccharide und dann Cellulosefasern)
    • vir-Faktoren (codiert von vir-Region) erkennen die Border-Sequenzen und setzen T-DNA Einzelstrang frei, es wird folglich ein Doppelstrang produziert
    • Dieser T-DNA-vir-Faktor Komplex wird in Pflanzenzelle geschleust und im Zellkern ins Genom integriert
    • Dort beginnt die Produktion der auf der T-DNA codierten Gene
    • Im Natürlichen Ti-Plasmid sind das Gene, die für Opine und Wachstumshormone codieren

 
  • In der Gentechnik kann man sich das zu nutze machen
    • Die Tumorgene der T-DNA werden inaktiviert oder entfernt
    • Fremdgene werden an dieser Stelle ins Ti-Plasmid integriert.
    • Das rekombinante Plasmid wird wieder in die A. tumefaciens Zelle transferiert.
    • Infektion der Zelle mit dem rek. A. tumefaciens

  • Die Gene für den Transfer der T-DNA sind nicht in der T-DNA enthalten, sondern in einem anderen Bereich des Ti-Plasmids, der vir-Region. Gene dort:
    • erkennen Signalsubstanzen von verwundeten Pflanzen
    • Lösen T-DNA aus Ti-Plasmid und transferieren ins Pflanzengenom

  • Wenn man Zielgene aus ganz fremden Organismen einbringt:
    • Man sollte Codon Usage anpassen (anders als bei Säugetieren)
    • Destabilisierende ATTA Sequenzen vermeiden
 
 
  
Weiterer Text:
Dies macht man sich in der Gentechnik zunutze, indem man das Plasmid, das Tumorbildung und Opinproduktion auslöst, stilllegt und um ein kleineres Plasmid mit Fremdgenen ergänzt, das zuvor in Escherichia coli zusammengesetzt wurde (binäres Vektorsystem).[3] Anschließend werden Pflanzenstücke mit diesen Bakterienstämmen infiziert, transgene Gewebe selektiert und mittels In-vitro-Kultur wieder zu vollständigen Pflanzen herangezogen.[3][4][5]

Damit Agrobacterium tumefaciens Pflanzenzellen transformieren kann, müssen diese als Folge einer Verletzung phenolische Substanzen ausschütten, die als „Lockstoff“ für das Bakterium dienen. Da nur sehr wenige einkeimblättrige Pflanzen dies tun, ist der Einsatz weitgehend auf zweikeimblättrige Pflanzen begrenzt, allerdings konnte durch Zugaben entsprechender Stoffe (z. B. Acetosyringon)[6] das Anwendungsgebiet auf einige Einkeimblättrige und sogar Pilze vergrößert werden.

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