Biotechnologie 2

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Rek. Proteinproduktion

Was versteht man unter direkter Expression von Proteinen. Was wäre die Alternative. Welche Vor- und Nachteile haben die 2 Methoden?

Bei der direkten Expression werden nur die (gen-)regulatorischen Sequenzen des Wirtsstammes wie Promotor oder Terminator an das (heterologe) Gen (kodierende Bereich) angehängt.
 
Vorteil:
AA-Sequenz ist daher zu 100% identisch, keine zusätzlichen AA hängen am Protein. Proteineigenschaften daher oft unverändert, wenn PTMs passen.
 
Nachteil:
Es gibt wenige Manipulations- und somit Verbesserungsmöglichkeiten. Im Gegensatz zur direkten Expression lässt sich bei der Fusionsproteinstrategie die Expression, Löslichkeit, Detektion (Epitop Tags, GFP, etc.) und Reinigungsmöglichkeit eines rekombinanten Proteins verbessern.
 
 
Alternative:
Fusionsexpression von Proteinen
 
Vorteil:
  • Ein gut exprimiertes Protein (Fusionspartner) vermittelt die nötigen Signale für die gute Expression eines anderen allein nur schlecht exprimierten Proteins. Häufig befindet sich am 5`Ende (N-Terminus) meist das gut exprimierte Fusionsgen(protein).
  • Expression:
    An den N-Terminus eines Proteins wird ein Fusionpartner angehängt. Ist meist ein natürlich hochexprimiertes Protein. Erhöht Stabilität des Proteins und Expression (mRNA) des Zielproteins.
  • Löslichkeit:
    Löslichkeit kann durch gut löslichen Fusionspartner erhöht werden, verhindert z.B. Inclusion Body Bildung.
  • Detektion:
    Protein kann über Fusionspartner oder Tags (Epitop Tag) durch Antikörper oder Bindungsprotein nachgewiesen werden (Western Blot). Andere Möglichkeiten sind die Anheftung eines GFP (Green Fluorescence Protein) zur Lokalisation.
  • Reinigung:
    z.B. durch Affinitätschromatographie oder Antikörper Bsp.: Glutathion-Sepharose im GST-System, Nickel Säule bei His Tag.
  • Zielsteuerung:
     Expression in ein bestimmtes Kompartiment oder Export aus Zelle

Nachteile:
  • Ev. höherer Arbeitsaufwand
  • Ev. Mehr Editing und mehr Aufklärungsforschung notwendig
  • Aufarbeitung bzw Abtrennung des Tags notwendig.
  • Eventuell unterschiedliche PTM und Faltung = unterschiedliche Funktion
  • Direkte Expression wenn möglich --> liefert exakte AA

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