Welche Vor- und Nachteile bringt die Fusionsproteinexpre... | Biotechnologie 2

Rek. Proteinproduktion

Welche Vor- und Nachteile bringt die Fusionsproteinexpression? Erklären sie die Vor- und Nachteile im Detail.

Tags oder Fusionsproteine. Meist N- oder C-terminal Fusion des Proteins zu einem kurzen Peptid (Tag) oder zu einem anderen Protein (Fusionspartner).

Dazu werden die beiden Gene auf DNA Ebene fusioniert: an das 5’ oder 3’ Ende der kodierenden Region des Gens wird zusätzliche Sequenz angehängt.

Vorteile:

Ein gut exprimiertes Protein (Fusionspartner) vermittelt die nötigen Signale für die gute Expression eines anderen allein nur schlecht exprimierten Proteins. Häufig befindet sich am 5`Ende (N-Terminus) meist das gut exprimierte Fusionsgen(protein).

Expression:
An den N-Terminus eines Proteins wird ein Fusionpartner angehängt. Ist meist ein natürlich hochexprimiertes Protein. Erhöht Stabilität des Proteins und Expression (mRNA) des Zielproteins.
Löslichkeit:
Löslichkeit kann durch gut löslichen Fusionspartner erhöht werden, verhindert z.B. Inclusion Body Bildung.
Detektion:
Protein kann über Fusionspartner oder Tags (Epitop Tag) durch Antikörper oder Bindungsprotein nachgewiesen werden (Western Blot). Andere Möglichkeiten sind die Anheftung eines GFP (Green Fluorescence Protein) zur Lokalisation.
Reinigung:
z.B. durch Affinitätschromatographie oder Antikörper Bsp.: Glutathion-Sepharose im GST-System, Nickel Säule bei His Tag.
Zielsteuerung:
Expression in ein bestimmtes Kompartiment oder Export aus Zelle

Nachteile:

Ev. höherer Arbeitsaufwand
Ev. Mehr Editing und mehr Aufklärungsforschung notwendig
Aufarbeitung bzw Abtrennung des Tags notwendig.
Eventuell unterschiedliche PTM und Faltung = unterschiedliche Funktion
Direkte Expression wenn möglich --> liefert exakte AA

Alternative:
Direkte Proteinexpression. Hierbei werden vor und nach dem Gen nur die regulatorischen Sequenzen des Wirtsstammes wie Promotor und Terminator angehängt

Tags oder Fusionsproteine. Meist N- oder C-terminal Fusion des Proteins zu einem kurzen Peptid (Tag) oder zu einem anderen Protein (Fusionspartner).

Dazu werden die beiden Gene auf DNA Ebene fusioniert: an das 5’ oder 3’ Ende der kodierenden Region des Gens wird zusätzliche Sequenz angehängt.

Vorteile:

Ein gut exprimiertes Protein (Fusionspartner) vermittelt die nötigen Signale für die gute Expression eines anderen allein nur schlecht exprimierten Proteins. Häufig befindet sich am 5`Ende (N-Terminus) meist das gut exprimierte Fusionsgen(protein).

Expression:
An den N-Terminus eines Proteins wird ein Fusionpartner angehängt. Ist meist ein natürlich hochexprimiertes Protein. Erhöht Stabilität des Proteins und Expression (mRNA) des Zielproteins.
Löslichkeit:
Löslichkeit kann durch gut löslichen Fusionspartner erhöht werden, verhindert z.B. Inclusion Body Bildung.
Detektion:
Protein kann über Fusionspartner oder Tags (Epitop Tag) durch Antikörper oder Bindungsprotein nachgewiesen werden (Western Blot). Andere Möglichkeiten sind die Anheftung eines GFP (Green Fluorescence Protein) zur Lokalisation.
Reinigung:
z.B. durch Affinitätschromatographie oder Antikörper Bsp.: Glutathion-Sepharose im GST-System, Nickel Säule bei His Tag.
Zielsteuerung:
Expression in ein bestimmtes Kompartiment oder Export aus Zelle

Nachteile:

Ev. höherer Arbeitsaufwand
Ev. Mehr Editing und mehr Aufklärungsforschung notwendig
Aufarbeitung bzw Abtrennung des Tags notwendig.
Eventuell unterschiedliche PTM und Faltung = unterschiedliche Funktion
Direkte Expression wenn möglich --> liefert exakte AA

Alternative:
Direkte Proteinexpression. Hierbei werden vor und nach dem Gen nur die regulatorischen Sequenzen des Wirtsstammes wie Promotor und Terminator angehängt

Tags oder Fusionsproteine . Meist N- oder C-terminal Fusion des Proteins zu einem kurzen Peptid (Tag) oder zu einem anderen Protein (Fusionspartner). Dazu werden die beiden Gene auf DNA Ebene fusioniert: an das 5’ oder 3’ Ende der kodierenden Region des Gens wird zusätzliche Sequenz angehängt. Vorteile : Ein gut exprimiertes Protein (Fusionspartner) vermittelt die nötigen Signale für die gute Expression eines anderen allein nur schlecht exprimierten Proteins. Häufig befindet sich am 5`Ende (N-Terminus) meist das gut exprimierte Fusionsgen(protein). Expression : An den N-Terminus eines Proteins wird ein Fusionpartner angehängt. Ist meist ein natürlich hochexprimiertes Protein. Erhöht Stabilität des Proteins und Expression (mRNA) des Zielproteins. Löslichkeit : Löslichkeit kann durch gut löslichen Fusionspartner erhöht werden, verhindert z.B. Inclusion Body Bildung. Detektion : Protein kann über Fusionspartner oder Tags (Epitop Tag) durch Antikörper oder Bindungsprotein nachgewiesen werden (Western Blot). Andere Möglichkeiten sind die Anheftung eines GFP (Green Fluorescence Protein) zur Lokalisation. Reinigung : z.B. durch Affinitätschromatographie oder Antikörper Bsp.: Glutathion-Sepharose im GST-System, Nickel Säule bei His Tag. Zielsteuerung: Expression in ein bestimmtes Kompartiment oder Export aus Zelle Nachteile : Ev. höherer Arbeitsaufwand Ev. Mehr Editing und mehr Aufklärungsforschung notwendig Aufarbeitung bzw Abtrennung des Tags notwendig. Eventuell unterschiedliche PTM und Faltung = unterschiedliche Funktion Direkte Expression wenn möglich --> liefert exakte AA Alternative : Direkte Proteinexpression. Hierbei werden vor und nach dem Gen nur die regulatorischen Sequenzen des Wirtsstammes wie Promotor und Terminator angehängt

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