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Rek. Proteinproduktion

Skizzieren sie einen prokaryontischen Expressionsvektor. Erklären sie die Funktion/Bedeutung der Teile, die für die Proteinexpression relevant sind jeweils in einem Satz.

 
Schematische Darstellung der wichtigsten Bestandteile eines bakteriellen Expressionsvektors. Je nach Vektortyp können sich unterschiedliche Teile auf einem Plasmid befinden.
Plasmidgrösse: Möglichst Klein, ca 3 kb
 
Nicht direkt für Proteinexpression:
  • Ori:
    origin of replication     Replikationsursprung.
    • Erlaubt die DNA Replikation unabhängig vom Chromosom.
    • Kontrolliert Kopienzahl im Bakterium (1-1000): Single – High Copy Plasmid.
  • Selektionsmarker:
    Identifizierung und Selektion transformierter Zellen.
    • Antibiotikaresistenzgene: Ampicillin (bla) , Tetracyclin etc.
    • lacZ (Teil des Gens für β-Galactosidase): Blau-Weiss Selektion, meist nur in Klonierungsvektoren vorhanden.
    • Auxotrophe Marker: Oft Gene für Synthese von Aminosäuren oder Nucleotiden. Auxotrophe Mutanten werden durch funktionielles Gen zur Prototrophie gebracht (Komplementation).
 
Direkt für Proteinexpression (genregulatorische Komponenten):
  • Promotor
    • Regulatorische Sequenz, verantwortlich für die Wechselwirkung mit Transkriptionsfaktoren, die den Transkriptionsstart durch RNA Polymerase vermitteln.
    • Prokaryontischer Promotor befindet sich ca 10-100 Nukleotide upstream der Ribosomenbindungsstelle, haben einheitliche Struktur (im Ggs. zu Eukaryonten).
    • Aufgrund der Regulation werden induzierbare, reprimierbare und konstitutive Promotoren unterschieden.
    • Eigenschaften des “idealen” Promotors zur Proteinproduktion:
      • Stärke: Produkt kann bis zu 50% des Gesamtproteins ausmachen.
      • Leicht induzierbar (reprimierbar), billiger Inducer.
      • Sehr schwacher basaler Expressionslevel im nicht induzierten Zustand: verhindert mögliche Produkttoxizität oder Selektionsnachteil in der Wachstumsphase der Fermentation.
  • Shine-Dalgarno Sequenz:
    • Translationinitiation (kompl. 16S rRNA).
    • Bestimmt Effizienz der Translationinitiation und befindet sich 4-14 Nukleotide upstream des Start codons (optimal 8 Nuc).
  • Multiple Cloning Site (Polylinker): Erkennungs- und Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen zur Insertion des DNA Fragments.
  • Start Codon:
    • Initiationpunkt der Translation.
    • Meist ATG.
  • Stop Codon:
    • Termination der Translation.
    • 3 mögliche Stops, wobei TAA bevorzugt wird gegenüber TAG and TGA.
    • Die Effizienz verbessert sich durch die Benutzung v. 2 oder 3 Stop Codons in Serie.
  • Terminator.
    • Transkriptionelle Termination
    • reduziert ungewollte Transkription und verstärkt Plasmid und mRNA Stabilität.
  • Regulatorgen (Repressor).
    • Viele Promotoren sind “leaky”. d.h. es werden Genprodukte in geringen Mengen ohne die Zugabe eines Inducers produziert.
    • Repressoren werden nur in geringen Mengen produziert, aber zusätzliche Kopien der Repressorbindungsstelle werden durch die Expressionsplasmide eingebracht. Führt zur Titration des Repressors.
    • Dies ist ein Problem bei toxischen Genprodukten, ausserdem haben Zellen, die Plasmid verlieren bzw die rek. PP inaktivieren, einen Selektionsvorteil.
    • Lösung: Konstitutive Expression eines Repressorproteins, um ungewünschte Expression während der Wachstumsphase zu verringern.
    • Bsp: 
      lac-Promoter und davon abgeleitete Hybridpromotoren sind leaky und werden daher durch Insertion einer lac-Operator Sequenz und der Expression des Lac Repressors (LacIq) reguliert. Kohlenstoff Katabolit Repression weiters durch Zugabe von 1% Glukose ins Kulturmedium.

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