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Rek. Proteinproduktion

Welche Promotoren kennen sie für die Proteinexpression in E. coli? Nennen sie kurz die wichtigsten Eigenschaften von 3 Promotoren und wie sie reguliert sind.

lac Promoter des lac Operons:
  • Lactose oder IPTG Induktion, reprimierbar durch Glukose.
  • lacUV5 Promoter: weniger stark reprimierbar, keine Kohlenstoff-Katabolit-Repression (Glucose reprimiert nicht)
  • Nachteil: „leaky“ durch die Titration des Repressorproteins LacI (10 Moleküle pro Zelle).
  • Mutierter lacI Promoter: lacIQ führt zu höherer Expression des LacI (ca 10x).
  • Lac Promoter und lacUV5 (noch) verhältnismäßig schwach.

Synthetische Hybridpromotoren wie tac und trc Promoter:
  • ca 10x stärker als lacUV5.
  • Bestehend aus -35 Region des trp (Tryptophan) Promoters und -10 Region des lac Promoters.

T7 Promoter System (pET Vektoren):
  • Proteinausbeute bis 50%
  • Phagen T7 RNA Polymerase transkribiert nur DNA nach T7 Promoter.
  • Einsatz des Gens der T7 Phagen RNA Pol unter Kontrolle des lacUV5 Promoters, damit Lactose/IPTG induzierbar.
  • Basale Expression kontrollierbar durch lacIQ  bzw noch zusätzlich durch T7 Lysozym. T7 Lysozym bindet an T7 RNA Polymerase und inhibiert Transkription.
  • Insertion des lacO Operators downstream des T7 Promoter: verhindert zusätzlich basale Expression der T7 RNA Polymerase.
  • Alternative Erklärung:
    • STOP:
      • Der lacI Repressor verhindert Transkription vom lacUV5 Promotor und somit T7 RNA Pol Expression und Produktion.
      • LacI bindet auch an eingebrachten lac operator downstream des T7 Promoters damit auch keine "leaky gebildete" T7 RNA Pol binden kann.
      • Zusätzlich wird T7 Lysozym von einem weiteren Plasmid (pLysS oder pLysE) exprimiert, um zusätzlich T7 RNA Polymerase zu inhibieren.
    • GO:
      • IPTG Zugabe führt dazu, dass lacI Repressor von beiden Promotoren abdissoziert
      • Transkription vom lacUV5 zur T7 RNA Pol Produktion. T7 RNA Pol liest Gen ab. T7 Lysozym wird austitriert.
 
araPBAD Promoter (pBAD Vectoren):
  • positive Kontrolle.
  • AraC wirkt als Repressor und Aktivator.
  • AraC reprimiert, durch Inducerzugabe (= L-Arabinose) aktiviert.
 
pL: regulierbarer λ Phagenpromoter (frühe lytische Gene).
  • λcI Repressorprotein reprimiert Transkription,
  • Inaktivierung über SOS Antwort (DNA Schädigung) vermittelt durch Nalidixinsäure (DNA Gyraseinhibitor).
  • Alternativ Kontrolle der λcI unter trp Promoter. --> Tryptophanzugabe blockiert λcI Repressorsynthese.
 
Physikalische Signale:
  • Neben chemischen Signalen auch physikalische Signale wie Temperatur und pH möglich.
  • Über pL Promoter:
    • Mutiertes λcI Repressorprotein ( λcI857) ist temperatursensitiv, instabil über 37°C. Temperaturshift auf 40–42°C.
  • cspA
    • Kälte induzierbarer Promotor
    • bei 15°C aktiv. Tw bis 20–40%Protein möglich.
 

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