Biotechnologie 2

Rek. Proteinproduktion

Skizzieren sie einen Expressionsvektor für die intra- und extrazelluläre Proteinproduktion in Pichia pastoris? Benennen sie die Teile und erklären sie ihre Funktion in einem Satz.

Intrazelluläre Expression:
  • Möglichkeit der Integration ins Genom (Schnitt mit Restriktions Enzym: lineare Transformation) oder episomal (Plasmid, zirkuläre Transformation): Stabilität!

  • Einsatz v. Shuttle Vektoren (binärer Vektor): Kann sowohl in E. coli wie P. pastoris verwendet werden, da er für jeden Organismus einen Replikationsstartpunkt bzw Selektionsmarker (Zeocin) besitzt.

  • Selektionsmarker: Zeocinresistenz: Phleomycin ist ein kupferchelatierendes Glykopeptid-antibiotikum (DNA).

  • Expressionssignale: AOX1
    Promotor u. Terminator

  • Multiple Cloning Site

  • c-myc Epitop: Antikörpererkennungstelle

  • His Tag:
    Reinigung und AK-Erkennung.

 
Extrazelluläre Expression:
  • Unterschied zur intrazellulären Expression:
    Vorhandensein einer Signalpeptidsequenz für den α-Faktor (Pheromon) von S. cerevisiae.

  • Signalsequenz:  Eine Peptidsequenz mit der Informationen, wie und wohin dieses Protein innerhalb der Zelle transportiert werden soll.
    Signalpeptid für den Sekretionsweg. Wird N-terminal an das Protein angehängt, aber am Beginn des Sekretionswegs abgespalten.

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